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督灸疗法是集经络、穴位、艾灸、中药为一体的特色中医外治疗法，具有补肾通督、开窍益智、温补阳气、散寒通络、调和阴阳等功效。督灸疗法能够改善和提高衰老小鼠的学习记忆能力，为防治阿尔兹海默病开辟了独具特色的中医外治疗法。
［摘要］目的：探讨督脉灸疗法（督灸）对阿尔兹海默病模型小鼠学习记忆能力及海马CA1、CA3区HE染色的影响。方法：将40只SAM小鼠随机分为正常组、模型组、督灸组、中药组和督灸+中药组各8只，其中督灸组采用督灸疗法，中药组给予六味地黄丸灌胃，实验结束后，采用Morris水迷宫实验法进行行为学检测，HE染色法检测CA1、CA3区组织形态学改变。结果：与模型组相比，中药组、督灸组、督灸+中药组的小鼠逃避潜伏期均降低（P＜0.05或P＜0.01），其中督灸组和督灸+中药组用时最短，与中药组比较（P＜0.05或P＜0.01），表明督灸疗法可提高SAMP8小鼠学习记忆能力，且疗效优于中药组；HE染色结果显示，相比正常组，模型小鼠CA1、CA3区细胞组织均有坏死损伤，相比模型组，督灸组和督灸+中药组CA1、CA3区细胞坏死数量最少，形态学改变最轻，中药组损伤较为明显，说明督灸疗法对SAMP8小鼠海马CA1、CA3区神经元具有保护作用，可减少细胞损伤。结论：督灸疗法能提高SAMP8小鼠学习记忆能力，其机制与督灸能保护海马CA1、CA3区神经元和抑制细胞损伤有关。
阿尔茨海默病（AD）是老年人常见的神经系统变性病，病因尚不明确，渐进型记忆障碍是其典型的病证表现之一，以近记忆障碍为最早的症状和最突出的认知障碍，严重影响老年人的生活质量，发病率呈上升趋势。目前尚无特效治疗方法和药物。中医外治法在AD的治疗中有广阔的发展前景。前期研究证实督脉灸疗法（督灸）具有补肾通督、影响脑髓功能之效，据此我们通过Morris水迷宫实验和病理检测（HE染色），观察督灸对衰老加速小鼠（SAM）记忆功能的影响，从而探讨其作用机制。
1材料
1.1动物
在SAM品系中，SAMP8小鼠是以学习记忆功能衰退为特征的加速老化模型，既有自然衰老小鼠的特征，又有类似老年性痴呆的脑部病理及学习记忆功能衰退。SAMR系呈现衰老抗性，SAMR1作为正常对照组。本实验选取6月龄SAM小鼠40只，均为雄性，体质量（32.3±2）g，全部购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）-。
1.2主要仪器
Morris水迷宫实验仪器（上海欣软科技有限公司），脱水机（JJ-12J）、包理机和冻台（均为武汉俊杰电子有限公司），病理切片机（上海徕卡仪器有限公司），正置光学显微镜（日本尼康NikonEclipseCI），成像系统（日本尼康NikonDS-U3）。
1.3药物与主要试剂
六味地黄丸（南京同仁堂药业有限责任公司，批号），督灸粉主要组成：附子，肉桂，丁香，杜仲，熟地黄，牛膝，菟丝子，山药，麝香，每只小鼠1次督灸取用0.2g。主要试剂：无水乙醇、二甲苯、盐酸、氨水和中性树胶（均为国药集团化学试剂有限公司），苏木素-伊红染液（南京建成公司）。
2方法
2.1分组及模型建立
实验共分成五组，各8只小鼠。正常对照组（正常组）选取SAMR1小鼠，正常饲养。另外四组选取SAMP8小鼠，正常饲养至6月龄，按随机数字表法分组为：模型对照组（模型组），中药干预组（中药组），督灸干预组（督灸组），督灸+中药干预组（督灸+中药组）。其中中药干预给以六味地黄丸灌胃，督灸干预给以督灸方法治疗。
2.2督灸与给药
督灸方法：动物麻醉后，俯卧固定于手术台，剃除自颈部至尾部的背毛。①于动物背部刷一层姜汁，②沿脊柱撒督灸粉呈线条状，③姜泥牢固铺在动物背部，姜泥底宽0.7cm，高0.4cm，顶宽0.3cm，形如梯形，④在姜泥上面放置圆柱形艾炷，艾炷直径约0.25cm，⑤点燃艾炷两端及中间，1壮灸完再换1壮，连续灸3壮。督灸治疗共8次，间隔3d督灸1次，共22d。给药方法：灌胃给予六味地黄丸（浓缩丸）22d，剂量0.1g/10g，每只1mL，每日2次。
2.3Morris水迷宫实验
动物干预结束后开始，实验共6d，第1，2天动物学习训练，每天训练4次，使用伪随机的方式从水迷宫的四个出发点出发，记录到达平台的潜伏期（逃避潜伏期）。若在训练阶段s内未找到平台，则放置于平台上学习10s。每次训练间隔60s。第3天动物休息，第4～6天，重复训练阶段的程序，只是在s内未找到平台则不再放置于平台上学习。记录找到平台的潜伏期。
2.4HE染色
通过取材、脱水、包埋及切片程序备好石蜡切片，然后进行HE染色。①石蜡切片脱蜡至水，②苏木素染细胞核，③伊红染细胞质，④脱水封片，⑤显微镜镜检，图像采集分析。染色结果：细胞核蓝色，细胞质红色。
2.5统计学方法
采用SPSS21.0统计软件进行分析。两组比较采用t检验，多重比较采用单因素方差分析，统计结果用x±s表示。取α=0.05为检验水准。
3结果
3.1干预后各组小鼠水迷宫实验5d平均逃避潜伏期的比较
模型组小鼠平均逃避潜伏期较正常组明显延长（P＜0.05），表明模型组小鼠的学习记忆能力下降；中药组、督灸组、督灸+中药组的指标均优于模型组（P＜0.05），表明中药和督灸均可提高小鼠的学习记忆能力；督灸组和督灸+中药组小鼠的平均逃避潜伏期均较中药组明显降低（P＜0.05），表明督灸提高小鼠学习记忆能力的疗效优于中药治疗；督灸组和督灸+中药组差异统计学意义（P＞0.05）。
3.2干预后各组小鼠水迷宫实验逃避潜伏期的比较
与正常组相比，SAMP8模型小鼠逃避潜伏期明显延长（P＜0.05或P＜0.01），表明模型小鼠的学习记忆能力明显减退；中药组、督灸组和督灸+中药组均优于模型组（P＜0.01），表明中药和督灸均能提高小鼠的学习记忆能力；督灸组、督灸+中药组又较中药组优势明显（P＜0.05或P＜0.01），表明督灸在提高SAMP8小鼠的学习记忆能力方面优于中药治疗。督灸组与督灸+中药组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。
3.3干预后对各组小鼠海马区CA1、CA3区HE染色的影响（见图）
模型组：海马CA1和CA3区细胞固化萎缩，整个细胞深染；中药组：海马CA1和CA3区细胞固化萎缩，细胞间结构松散；督灸组和督灸+中药组：海马CA1和CA3区细胞坏死明显减少。
相比正常组，模型组海马CA1与CA3区均有损伤，细胞坏死；相比模型组，中药组疗效并不明显，督灸组有一定抑制细胞坏死的疗效，督灸+中药组疗效与督灸组相似，具有显著效果。表明督灸疗法能保护SAMP8小鼠海马CA1、CA3区神经元，减少细胞损伤的数量。
4讨论
阿尔兹海默病（AD）属中医学呆病、善忘、郁证等范畴，患者多为老年群体，病因繁多，病机复杂，涉及心、肝、脾、肾等脏腑的功能失调，其病位在脑。肾精亏虚，脑窍失养为本；痰瘀阻络，清窍被扰为标，终致“髓海不足，神机失用”，发为痴呆。
水迷宫实验主要用来研究动物的学习、记忆能力，具有客观准确的特点。从实验结果可知，督灸可减少SAMP8小鼠寻找平台所用时间，明显提高SAMP8小鼠的学习记忆能力。《医林改错》曰：“灵机记性不在心而在脑”。督脉循行“上至风府，入属于脑”，具有开窍、醒神、益智之功。脑窍位于高巅之上，需清阳之气推动精髓上输，濡润神明。督灸疗法即可温补清阳，又可温通经络，可助清阳上升，濡脑明神开窍。
HE染色结果表明督灸对SAMP8小鼠脑组织具有保护作用，可明显减少小鼠海马CA1、CA3区神经元的损伤。海马的CA1、CA3区与学习记忆能力密切相关，现代研究证实，阿尔兹海默病患者海马区神经元的丢失，是导致学习记忆能力下降的主要原因。此外，有研究分析指出AD的海马结构中的突触素含量明显降低，而突触素的含量变化与空间学习记忆的建立密切相关。神经元的存活数量将会直接影响到神经突触的可塑性，而海马CA1、CA3区的神经突触的形成有助于学习记忆能力的提高。
学习记忆能力古人称之为“志”。“肾藏志”，督脉循行入脑络肾，肾可主骨生髓，精髓源于肾，循督脉入脑窍发挥濡养、滋润的功能，《灵枢·经脉》云：“人始生，先成精，精成而脑髓生”。脑主神明且为“髓海”，精髓是神明得以清灵、发挥功能的物质基础。督脉络于肾，肾为先天之本，督灸疗法可温补肾阳、填补肾精，资助蕴藏于肾内的元阴元阳，故可使亏损之肾精得以充盈，髓海化生有源，则神明可濡，神机复明，呆病可愈。此外，中医学认为痴呆的病机以本虚为主，AD患者多发于老年人，脏器渐衰，气血亏虚，日久则可产生痰、湿、瘀、郁等实邪内阻，渐成本虚标实之证。故而治疗AD应以“扶助正气”为主，督脉为“阳脉之海”，灸之可温阳、益气、开窍，扶正祛邪。《难经·八难》说：“气者，人之根本也”。“气”是推动、调控脏腑生理活动和新陈代谢的动力，气能生血行血、生津行津、生精摄精，“神明”功能得以正常发挥需要脑髓的滋养，亦离不开“气”调控和推动。脑为清窍，督脉通于脑窍，督灸可温补气血，助清阳上输于脑；亦可温化痰湿，行气解郁，化瘀开窍，助“失用”的神机“复明”。
督灸疗法是集经络、穴位、艾灸、中药为一体的特色中医外治疗法，具有补肾通督、开窍益智、温补阳气、散寒通络、调和阴阳等功效。督灸疗法能够改善和提高SAMP8小鼠的学习记忆能力，对防治阿尔兹海默病开辟了独具特色的中医外治疗法。进一步阐释督灸治疗AD的机制和原则，对逐步探明外治法延缓AD发病的机制，预防痴呆，提高国民生活质量，降低AD发病率，有着重要的理论和临床意义，且安全有效的外治疗法具有更广阔的应用前景。目前，临床上仍缺乏有效治疗AD的方法，我们应当另辟蹊径，发散思维，治已病，防未病，重视中医外治疗法在此领域的独特优势。
［基金项目］山东省自然科学基金资助项目（编号：ZRHM）；山东省重点研发计划资助项目（编号：GSF）
［通信作者］杨继国（-），男，教授，主任医师，硕士研究生导师，研究方向：刺法灸法的临床应用与研究，E-mail：jiguoyang
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