海马突触发育对社会认知的影响

报告人：徐楠杰

整理人：田嘉禾

年12月29日，上海交通大学医学院徐楠杰研究员受复旦大学脑科学研究院解云礼研究员的邀请于复旦大学枫林校区治道楼8楼会议室，围绕“HippocampalSynapseDevelopmentforSocialCognition”展开了一场学术讲座。徐楠杰研究员从神经发育的研究角度，阐述了大脑重要核团神经元突触形成的分子机制，以及突触形成和社交认知之间的联系，为我们更好地理解神经精神类疾病提供了细胞和分子生物学基础。

研究背景

中枢神经系统这个巨大的神经元网络，是由天文数字的突触相互连接起来的，突触连接随着大脑的发育呈现动态的变化，在连接到一定阶段后，其连接数量的增加和消除会达到相应的动态平衡，从而形成神经元的特异性结构。在与大脑学习记忆相关的重要核团海马中，神经元之间突触的形成与稳定是决定大脑出生后早期功能的结构基础，对社交活动、方向定位、认知记忆等重要行为的产生发挥关键调节作用。

图1，突触组织信号传递(ShenK,etal,AnnuRevNeuronsci,)

突触的形成和成熟依赖于突触前和突触后结构的互动协调合作。突触小泡的运输，突触前和突触后区域的分化、受体和支架的募集可以由多种信号驱动，亦有顺向传递和逆向传递的区分(如图1)。突触发育异常往往会产生先天性恐惧等神经功能失调的表现，甚至神经精神疾病如自闭症和精神分裂症等。因此，理解突触的形成过程以及其分子调节机制一直是神经科学领域研究的重要问题。

内容Ⅰ：大脑重要核团神经元突触形成的分子机制

1.研究靶标

1.1Ephrin-B-EphB家族

一类参与神经元轴突和树突发育的重要双向信号分子家族，EphB是酪氨酸激酶受体，与其配体Ephrin-B的共同特点是都表达在细胞膜上，二者的结合依赖于细胞膜之间的接触，与突触前和突触后所形成的范式相吻合；此外，两个细胞接触之后，除可以传递Ephrin-B引导的正向信号以外，EphB被Ephrin-B激活而导致细胞内蛋白磷酸化，受体可以向配体传递反向信号，反映了突触间的双向调节，因可同时调控配体表达的细胞和受体介导的细胞，而构建了研究突触形成的良好分子切入点。

1.2苔藓纤维

在海马发育过程中，DG区颗粒细胞向CA3区神经元投射的苔藓纤维(MossyFiber，MF)轴突能够沿着CA3区神经元胞体层的上下方向生长，形成两股完全分离的轴突束：上行锥体束（supra-pyramidalbundle；SPB）和下行锥体束（infra-pyramidalbundle；IPB）。其中下行锥体束能够随海马发育过程修剪轴突，显示出IPB轴突逐渐变短的形态学变化（图2L）。并且，苔藓纤维末梢具有一个巨大的末端，使它们对突触后结构形成包裹状，其内含的CA3区神经元树突棘上有许多囊泡释放位点且易于被激活（图2R）。二者特殊的形态有利于观察突触形成和成熟过程中突触前后结构的动态协同过程。

图2，海马苔藓纤维突触结构L：下行纤维束(IPB)发育修剪过程(Vanderhaeghen,P.etal,ColdSpringHarbPerspectBiol,)R：典型突触结构和MF突触结构(Nicoll,R.A.etal.NatRevNeurosci.)

1.3Lnx1蛋白

LigandofNumbproteinX，一种在CA3区锥体神经元突触后特异性表达的PDZ支架蛋白。Lnx1的表达时程是出生后开始表达，与神经元突触形成时程十分吻合，所以推测它可能作为配体参与调控突触后的突触形成；免疫荧光结果发现，Lnx1在脑内的表达具有特异性，仅在海马CA3区高度表达(图3)；用抗体染色，Lnx1特异地表达在突触后，提供了研究CA3区的分子靶点。

图3，Lnx1在海马CA3区锥体细胞层有特异性表达(LiuXDetal.JCellBiol.)

2.研究成果

2.1正向调节：轴突ephrin-B3靶向海马-杏仁核(BLA)的突触形成以调节先天恐惧

在这项工作中，徐楠杰团队通过跨核团环路的配体（ephrin-B3）和受体（EphB2）相互作用机制，确认了在小鼠发育关键期，海马CA1区与BLA之间的突触联系介导了最早的本能恐惧(如图4)。

图4，神经元连接的突触前和突触后定时协调模型(ZhuXNetal.,NatCommun.)

在小鼠出生的12-16天，发现CA1区的ephrin-B3和表达在杏仁核当中的EphB2，通过胞膜接触发生特异性结合，引导长距离神经环路的形成从而调节BLA突触的成熟，并利用高架十字迷宫和食肉动物气味分别诱导两种引发先天性恐惧的行为学方法，证明了Ephb2酪氨酸激酶依赖的正向信号在杏仁核神经元突触形成和成熟中的重要作用，揭示了在早期本能恐惧行为产生过程中，海马和杏仁核之间的突触连接和整合处理的分子机制(如图5)。

图5，EphB2信号介导树突棘增生产生先天恐惧模型(ZhuXNetal.,JNeuronsci.)

2.2逆行调节：海马CA3区Lnx1-GluN2B-EphB2复合物靶向突触形成与成熟

徐楠杰课题组深入探讨了由海马DG区向CA3区投射的苔藓纤维轴突形成的MF-CA3突触结构的成熟过程。通过遗传学手段将Lnx1基因敲除后发现，海马MF轴突在发育过程中发生了剪切障碍，表现为轴突显著增长及成熟突触的减少。电镜及电生理实验进一步表明MF轴突末端成熟异常以及囊泡数量减少(图6-7)。

图6，MF-CA3的突触前后膜电镜示意图(LiuXDetal.JCellBiol.)

图7，MF-CA3通路的EPSC记录(LiuXDetal.JCellBiol.)

通过进一步的蛋白筛选发现，表达于CA3锥体细胞上的酪氨酸激酶受体家族EphB受体参与了这一过程，将Lnx1全身敲除后，表现为海马区EphB受体的特异性降低，在原位杂交中，Lnx1与EphB表现出强烈的共定位(图8)。Lnx1通过与EphB结合形成复合物，且结合位点在Lnx1的第二个PDZ(PDZ2)结构域，促进了受体在突触后膜上的稳定性，防止其被输送到蛋白酶体中进行降解。

图8，Lnx1和EphB2在CA3锥体细胞层的共定位情况(LiuXDetal.JCellBiol.）

继续深入探究Lxn1是否影响突触后的离子通道和信息传导。借助Co-IP技术发现，Lnx1与海马内NMDAR，特别是GluN1和GluN2B这两个通道特异性结合，结合位点在Lnx1的第一个PDZ(PDZ1)结构域(图9a-e)。EphB2和GluN2B几乎没有直接的相互作用，Lnx1的存在则大大增加了这种相互作用。接下来，缺失Lnx1对NMDAR表达情况进行探究，发现在PW3和PW6Lnx1?/?小鼠中，GluN2B水平有所下降，而GluN1水平保持不变。同时，当加入Ifenprodil（GluN2B拮抗剂）时，NMDAR/AMPAR比率降低，而加入PEAQX（GluN2A拮抗剂）时比率不变。这些数据表明Lnx1对海马CA3神经元突触后GluN2B表达的稳定性至关重要。

图9，Lnx1是NMDAR和EphB2多蛋白复合物的骨架蛋白(LiuXDetal.MolPsychiatry.)

至此提示，在海马发育过程中，特异性表达于CA3区神经元突触后膜的Lnx1蛋白能够分别在PDZ的前两个结构域，与突触后离子通道NMDA受体和EphB2受体结合，通过阻止蛋白酶体降解途径，稳定突触后Lnx1-GluN2B-EphB2复合物。一方面，EphB受体能够通过表达在苔藓纤维上的ephrin-B3配体，逆向协调突触前轴突末梢的靶向成熟过程，影响DG颗粒细胞和CA3锥体细胞之间的突触形成；另一方面，正向影响NMDA介导的钙离子信号，调控突触后的树突棘成熟(图10)。

图10，Lnx1-GluN2B-EphB2复合物示意图(LiuXDetal.MolPsychiatry.)

内容Ⅱ：突触形成和社交认知之间的联系

1.突触形成与初始社交记忆的联系

接触、记忆和辨认不同的个体并触发一定的社会行为是社交过程的重要环节，社交记忆受损往往导致社交行为障碍从而表现出一系列精神疾病，如自闭症、抑郁症、精神分裂症等，这与大脑发育异常密切相关，但具体分子机制尚不清晰。

CA3区作为海马信号传导过程中的一个关键节点，一方面接受DG中MF的投射，另一方面将信息投射至CA1、CA2区，因此徐楠杰研究员组着手探究，海马不同亚区尤其是CA3区神经元与社交记忆和行为之间的关系。

图11，社交行为中的Lnx1?/?小鼠不同脑区c-fos阳性细胞的变化(LiuXDetal.MolPsychiatry.)

图12，海马CA3区神经元大量荧光信号的活动痕迹(LiuXDetal.MolPsychiatry.)

根据上述研究中Lnx1蛋白在海马CA3突触功能调节中的重要作用，首先，测试Lnx1基因敲除小鼠的社交行为，观察实验组小鼠分别与陌生小鼠和熟悉小鼠互动时c-Fos阳性神经元的激活情况，发现Lnx1?/?小鼠与熟悉小鼠互动时，海马DG区表达升高，CA3和CA1区表达下降(图11)。借助钙指示剂GCaMP6荧光蛋白，结合光纤记录系统记录社交过程中小鼠海马CA3区神经元Ca2+信号，在出生后第一天（P1）小鼠海马CA3区注射AAV病毒，21天后埋入光纤进行观察，与WT小鼠相比，图12中显示Lnx1?/?小鼠与熟悉小鼠互动时Ca2+信号明显减少。

图13，与陌生小鼠和熟悉小鼠社交过程行为轨迹图与社交指数统计学分析(LiuXDetal.MolPsychiatry.)

并且，在三项社交行为学实验中显示，面对陌生小鼠时Lnx1?/?小鼠行为与WT小鼠一致，表明其具有正常的社交行为；而当引入熟悉小鼠时，Lnx1?/?小鼠对其辨别能力明显下降，表现出与面对陌生小鼠类似的社交行为轨迹(图13)，提示这种识别能力缺陷可能是Lnx1缺失所致的初始社交记忆损伤。

图14，各病毒注射组的社会性指数和社会新颖性回避指数(LiuXDetal.MolPsychiatry.)

接下来，徐老师团队继续证明Lnx1?/?小鼠是否是通过Lnx1-GluN2B-EphB2复合物的破坏而导致初始社交记忆受损的动物表型。借助病毒注射技术在海马CA3区分别过表达全长Lnx1蛋白和PDZ1/2结构域突变Lnx1蛋白，结果显示(图14)，过表达PDZ1或PDZ2结构域突变Lnx1蛋白WT小鼠的社交指标降低，社交新奇回避指数较高，提示干扰Lnx1蛋白与NMDAR或EphB2的相互作用会损伤社会记忆的形成。而过表达全长Lnx1蛋白以及过表达EphB2则观察到了小鼠社交记忆的改善。

图15，WesternBlot检测Lnx1?/?小鼠突触后密度组分中GluN2B的表达(LiuXDetal.MolPsychiatry.)

研究还发现，过表达Lnx1或是EphB2蛋白后，Lnx1?/?小鼠海马CA3区NMDAR/AMPAR比值基本达到正常水平，且减少的c-Fos神经元数也得到恢复。然而，PSD的GluN2B水平可通过Lnx1的过表达而不是EphB2的过表达来恢复，提示EphB2对突触功能和社交记忆的改善作用不依赖于Lnx1或GluN2B表达水平的维持(图15)。

综上所述，这些结果证明了Lnx1-NMDAR-EphB2多蛋白复合物在海马CA3突触后介导发育中神经元突触功能的关键作用，是参与小鼠初始社交记忆的功能核心。

2.突触形成与早期社交隔离的联系

社交隔离(SI)在中枢神经系统中产生多种行为、形态和功能异常，尤其是早期SI被认为是精神健康问题的危险因素，可诱发情绪和认知等方面的障碍，但目前仍不清楚其中的具体作用机制，徐楠杰研究员组针发育期SI造成的记忆缺陷进行实验探究。

图16，与GH小鼠相比，SI(4W)小鼠的长时记忆受损(WuXRetal.TranslPsychiatry.)

首先，将出生后第4周(Pw4)小鼠进行SI，持续时间分别为2周、4周和12周，随后进行恐惧条件反射的训练，使其对某一特定环境与电击样行为耦联，形成稳定的恐惧记忆，以观测小鼠记忆存留及巩固的过程。测试1h、1d、7d时间点的动物表型，发现隔离4w以上的小鼠，与GH小鼠相比，SI小鼠在第7天即表现出记忆力明显下降(图16)。在免疫组化实验中发现，SI小鼠瘦长型树突棘和不成熟的突触明显增多；随之检测了Schaffer侧支-CA1通路中的LTP，这是学习和记忆的关键机制，观察到SI组与GH组相比，LTP水平降低，提示长期隔离可能损害了海马突触的可塑性。

图17，过表达EphB2可挽救SI小鼠的瘦长型树突棘和LTP诱导情况(WuXRetal.TranslPsychiatry.)

推及至分子机制，进一步探索NMDA、AMAP、EphB2等受体是否影响多蛋白复合物的功能而关联SI小鼠的记忆缺损。在蛋白定量检测中发现，SI的确下调了海马EphB2等受体的表达，且定位在海马CA1区最为显著，提示电击导致的认知障碍可能主要作用于CA1核团。通过在GH小鼠CA1区注射shRNA敲减EphB2，模拟出了与实验组SI小鼠类似的记忆缺损表型；而在CA1区过表达EphB2，又能明显挽救PW4小鼠在7d出现的记忆力下降，使其恢复至与GH小鼠相同的长时程记忆水平，且在形态学水平，过表达模型表现出与对照组小鼠相一致的瘦长型树突棘和LTP诱导的恢复情况(图17)，提示EphB2在SI诱导的记忆障碍中起着关键作用。

图18，EphB2在SI诱导的长时记忆遗忘中的作用模型(WuXRetal.TranslPsychiatry.)

因分子过表达可以挽救SI导致的记忆缺损而进一步思考，将SI小鼠重新放回社交环境中，是否可以恢复其记忆认知能力？最后，使PW4的SI小鼠在PW8重新回归社交活动，两周后检测发现，社交环境的重置升高了CA1区EphB2的水平，且行为学表现出与GH小鼠类似的记忆效果，提示在一定时间范围内，SI导致的记忆损伤与恢复是可逆过程。

由以上结果得出结论，社交行为在小鼠发育期是极其重要的(图18)，它作用于认知的巩固和记忆的保持过程；但当社交行为被阻断则会影响到海马核团的发育，尤其在于树突棘形成与突触成熟，从而导致学习遗忘的加速以及社交记忆的异常。

总结

徐楠杰研究员团队的近期研究在于发现特异性表达于海马CA3区神经元的骨架蛋白Lxn1，其能传递双向信号，既反向调节苔藓纤维的轴突靶向和突触成熟，又通过Lnx1-NMDAR-EphB2复合物正向调控发育期的社交记忆。此外，还证明了在社交隔离过程中，Lxn1介导多蛋白复合物的破坏而参与学习记忆的遗忘过程。

综上所述，本次讲座详尽阐释了酪氨酸激酶受体配体结合介导的神经细胞联系在关键神经核团之中的作用，以及Lnx1诱导的蛋白复合物参与神经环路的调节如何支持重要脑功能的产生，这是对大脑突触形成过程及调控机制方面的新发现，以及为我们更好地理解脸盲症等精神类病症的社交记忆和社交行为异常提供了新思路。

参考文献：

[1]KangShen,PeterScheiffele.GeneticsandCellBiologyofBuildingSpecificSynapticConnectivity.AnnuRevNeurosci.;33:–.

[2]ZhuXNetal.Ephrin-B3coordinatestimedaxontargetingandamygdalaspinogenesisforinnatefearbehaviour.NatureCommunications,Mar24,,DOI:10./n